武汉大学学报(医学版)   2018, Vol. 39Issue (6): 890-894   DOI: 10.14188/j.1671-8852.2018.6017.
0

引用本文 

刘苗, 唐荣, 夏利平, 姜毅. 泮托拉唑通过PI3K/Akt/mTOR信号通路逆转K562/A02化疗多药耐药的作用[J]. 武汉大学学报(医学版), 2018, 39(6): 890-894. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2018.6017.
LIU Miao, TANG Rong, XIA Liping, JIANG Yi. Effect of Pantoprazole on the Reversal of Multidrug Resistance Through PI3K/Akt/mTOR Signaling Pathway in Leukemia Cells[J]. Medical Journal of Wuhan University, 2018, 39(6): 890-894. DOI: 10.14188/j.1671-8852.2018.6017.

作者简介

刘苗,女,1982-,医学博士,主治医师,主要从事小儿血液疾病的研究, E-mail: liumiao915@163.com

课题来源

湖北省自然科学基金资助项目(编号:2014CFB395)

通讯作者

姜毅,男,1963-,医学硕士,主任医师,主要从事小儿呼吸及血液疾病的研究, E-mail: jiangyiwd@126.com

文章历史

收稿日期:2017-09-01
泮托拉唑通过PI3K/Akt/mTOR信号通路逆转K562/A02化疗多药耐药的作用
刘苗 , 唐荣 , 夏利平 , 姜毅     
武汉大学人民医院儿科 湖北 武汉 430060
[摘要] 目的: 探讨泮托拉唑对白血病耐药细胞K562/A02化疗耐药的影响, 探讨PI3K/Akt/mTOR信号途径在此过程中的作用以及P-gp、MRP1蛋白的表达。方法: 取对数生长期细胞,采用不同浓度泮托拉唑预处理(终浓度分别为50,100, 200 μg/ml)K562/A02细胞, 培养24 h,采用台盼蓝染色测定泮托拉唑对K562/A02细胞生长影响; 流式细胞术检测各组细胞的凋亡作用,RT-PCR和Western Blot方法检测各组细胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、P-gp、MRP1基因的表达。结果: 泮托拉唑预处理K562/A02细胞24 h,当终浓度为50,100, 200 μg/ml时,台盼蓝染色可见蓝染细胞,且随着浓度的增加,蓝染细胞增多。流式细胞术结果显示,阴性对照组K562/A02细胞凋亡率较低(3.26±0.12%),泮托拉唑(终浓度分别为50,100, 200 μg/ml)处理K562/A02细胞24 h后,凋亡率有所增加,分别为(15.79±1.03)%,(20.31±1.89)%,(41.72±2.57)%,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,50 μg/ml泮托拉唑预处理24 h可显著抑制K562/A02细胞内的p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、P-gp、MRP1 mRNA和蛋白水平的表达(P<0.05), 抑制作用随药物浓度的升高而增强,呈浓度依赖性(P<0.05)。当浓度升至200 μg/ml时,泮托拉唑对K562/A02细胞内p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、P-gp、MRP1基因抑制作用最为明显,与对照组相比,各基因mRNA水平的表达分别下降了(71.37±2.06)%,(62.29±4.17)%,(48.56±3.95)%,(52.05±4.26)%,(83.21±2.78)%;各基因蛋白水平的表达分别下降了(50.93±4.09)%,(45.64±4.75)%,(42.77±3.33)%, (39.29±2.34)%, (69.87±3.51)%,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论: 泮托拉唑可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,进而抑制P-gp和MRP1蛋白表达,以增强肿瘤细胞的化疗敏感性,逆转其对化疗药物的MDR。
关键词泮托拉唑    白血病    多药耐药    PI3K/Akt/mTOR通路    P糖蛋白    
Effect of Pantoprazole on the Reversal of Multidrug Resistance Through PI3K/Akt/mTOR Signaling Pathway in Leukemia Cells
LIU Miao, TANG Rong, XIA Liping, JIANG Yi     
Dept. of Paediatrics, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei, China
[Abstract] Objective: To investigate the effect of pantoprazole on drug resistance to chemotherapy in K562/A02 leukemia cells, and explore the role of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in this process and at the same time detect the expression of P-gp and MRP1. Methods: K562/A02 leukemia cells were incubated with different concentrations of pantoprazole (50, 100, 200 μg/mL) for 24 hours. The growth of cells was investigated by trypan blue staining when treated with pantoprazole. The apoptosis was detected by flow cytometry. The expressions of p-PI3K, p-AKT, p-mTOR, P-gp and MRP1 were detected by RT-PCR and Western Blot, respectively. Results: When treated with pantoprazole for 24h, blue cells could be found by trypan blue staining at the concentration of 50, 100, 200 μg/ml, and the blue cells increased with the increasing concentrations. It showed that the apoptosis of K562/A02 cells was very low in the negative control group ([3.26±0.12]%), meanwhile, when added with pantoprazole (50, 100, 200 μg/ml) for 24 h, the apoptosis of K562/A02 cells was increased, at the rate of(15.79±1.03)%, (20.31±1.89)%, (41.72±2.57)%, respectively (P < 0.05). Compared with the control group, pantoprazole, at the concentration of 50 μg/ml, could significantly inhibit the mRNA and protein expressions of p-PI3K, p-AKT, p-mTOR, P-gp and MRP1(P < 0.05). The inhibition was concentration dependent (P < 0.05), when treated with 200 μg/ml pantoprazole, it showed that the inhibition was the most obvious, and the mRNA expression of p-PI3K, p-AKT, p-mTOR, P-gp and MRP1 was down-regulated apparently, at a decrease rate of (71.37±2.06)%, (62.29±4.17)%, (48.56±3.95)%, (52.05±4.26)%, (83.21±2.78)%, respectively in comparison with control group(P≪0.05). At the same condition, the protein expression of p-PI3K, p-AKT, p-mTOR, P-gp and MRP1 was also decreased notably, with a decline rate of (50.93±4.09)%, (45.64±4.75)%, (42.77±3.33)%, (39.29±2.34)%, (69.87±3.51)%, respectively in comparison with control group (P < 0.05). Conclusion: Pantoprazole can enhance the sensitivity of tumor cells to chemotherapy and reverse its MDR, by means of inhibiting the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway and the expression of P-gp and MRP1.
Key Words: Pantoprazole    Leukemia    Multidrug Resistance    PI3K/AKT/mTOR    p-Glycoprotein    

白血病细胞对化疗药物的耐药是导致化疗失败及预后不良的重要原因,因此如何逆转耐药性成为目前研究的热门课题。经典的多药耐药(multidrug resistance, MDR)机制与MDR1基因及其产物P-糖蛋白有关[1, 2]。近年来,关于PI3K/Akt/mTOR信号通路与药物耐药性关系的研究越来越多,并被认为是化疗耐药治疗的新靶点。缺氧和酸化是肿瘤细胞微环境最主要的特征。研究发现[3]质子泵抑制剂(proton pump inhibitors, PPIs)在酸性环境中激活,并被检测到能逆转不同组织的肿瘤耐药。泮托拉唑为质子泵抑制剂,泮托拉唑是否通过抑制胞内PI3K/Akt/mTOR信号通路, 调节MDR耐药蛋白表达,逆转白血病细胞的化疗耐药?本研究对上述推测进行了验证。

1 材料与方法 1.1 试剂

泮托拉唑购于山东罗欣药业集团股份有限公司,新生牛血清及1640培养基购于Gibco公司,Annexin V/PI凋亡试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司,RT-PCR试剂盒购于Invitrogen公司,相关一抗体[p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)多克隆抗体]购自Cell Signal公司,相应二抗购自Pierce公司,蛋白电泳marker购自Fermentas公司。

1.2 方法 1.2.1 细胞培养

K562/A02细胞购自华中科技大学同济医学院基础医学院,在1640培养基(含10%Gibco新生牛血清,100 U/ml青霉素,100 μg/ml链霉素)中常规培养,培养条件为5% CO2,37 ℃。所有实验细胞均取自于对数生长期,台盼蓝拒染率均在95%以上。K562/A02细胞培养基内含1 000 ng/ml阿霉素以维持其MDR表型。

1.2.2 预处理

取对数生长期K562/A02细胞, 在pH 6.65的未缓冲培养体系中(弱酸环境可促进PPIs活化)以不同浓度泮托拉唑预处理24 h。

1.2.3 实验分组

实验分为A:阴性对照组;B: 50 μg/ml泮托拉唑组;C: 100 μg/ml泮托拉唑组;D: 200 μg/ml泮托拉唑组,共培养24 h后,收集各组细胞进行如下实验。

1.2.4 台盼蓝染色测定泮托拉唑对K562/A02细胞生长影响

取对数生长期K562/A02细胞, 调整细胞浓度均为1×106个/ml。将各组细胞按照1×105/ml接种于24孔板,每孔加入泮托拉唑(终浓度为5,10,20,50,100, 200 μg/ml),每个浓度设3个复孔,培养24 h后,收集细胞,离心后弃上清,30 μl PBS重悬细胞,加入0.4%台盼蓝混匀,5 min后计数,记录蓝染细胞及未染色细胞数目。

1.2.5 流式细胞术检测各组细胞的凋亡变化

利用Annexin V/PI试剂盒检测各组K562/A02细胞的凋亡。收集各组K562/A02细胞,按照1×105/ml接种于96孔板,根据说明书进行操作。各样品分别加入500 μl Binding Buffer,5 μl Annexin V,5 μl PI,混匀,室温避光反应5-15 min(同时设阴性对照),流式细胞仪上机检测。

1.2.6 RT-PCR方法检测各组p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、P-gp、MRP1基因mRNA表达

收集各组细胞,提取总RNA,检测各组细胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、P-gp、MRP1基因的mRNA表达。方法如下:①逆转录:根据Trizol一步法抽提总RNA,以Oligo(dT)15为反转录引物,各样品取相同量的RNA逆转录成cDNA。②PCR扩增:设计引物,取PCR产物8 μl, 加5× Loading buffer 2 μl, 2%琼脂糖凝胶电泳, 并对电泳条带进行分析。

1.2.7 Western Blot方法检测各组p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、P-gp、MRP1蛋白表达

① 蛋白抽提与定量:各组细胞加入200 μl蛋白裂解液,混匀,充分裂解后提取总蛋白。②免疫印迹检测目的蛋白:配置SDS-PAGE浓缩胶与分离胶,在电泳缓冲液中进行电泳,然后将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。在5%脱脂奶粉中进行抗体封闭,然后加入相应的一抗:p-PI3K(1:2 000),p-Akt(1:2 500),p-mTOR(1:2 000),P-gp(1:1 000)、MRP1(1:2 000)4 ℃冰箱过夜后,将硝酸纤维素膜用TBST液反复冲洗,再加入相应的二抗,摇床摇1 h后取出,TBST液反复冲洗,并以兔抗GAPDH(1:1 000)作为对照。随后进行显影及曝光,计算蛋白条带的吸光度值(IA=平均吸光度×面积)。

1.3 统计学处理

所有结果采用SPSS 12.0软件进行处理, 结果用x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析, 两组间比较用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 泮托拉唑对K562/A02细胞生长的影响

泮托拉唑(终浓度为5,10,20 μg/ml)培养K562/A02细胞24 h后,进行台盼蓝试验,几乎未见蓝染细胞。泮托拉唑(终浓度为50,100, 200 μg/ml)培养K562/A02细胞24 h后,进行台盼蓝试验,可见蓝染细胞,且随着浓度的增加,蓝染细胞增多。

2.2 泮托拉唑对K562/A02细胞的诱导凋亡作用

流式细胞术检测结果显示,阴性对照组K562/A02细胞凋亡率较低[(3.26±0.12)%],泮托拉唑(终浓度分别为50,100, 200 μg/ml)处理K562/A02细胞24 h后,凋亡率有所增加,分别为(15.79±1.03)%,(20.31±1.89)%,(41.72±2.57)%,与阴性对照组相比差异有统计学意义(t=3.895, P<0.05; t=4.263, P<0.05; t=4.717, P<0.05)。

图 1 泮托拉唑对K562/A02细胞的诱导凋亡作用 A:阴性对照组; B:50 μg/ml泮托拉唑; C: 100 μg/ml泮托拉唑; D:200 μg/ml泮托拉唑
2.3 泮托拉唑对K562/A02细胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、P-gp、MRP1基因mRNA表达的影响

与对照组相比,50 μg/ml泮托拉唑预处理24 h可显著抑制K562/A02细胞内的p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、P-gp、MRP1基因mRNA水平的表达(P<0.05), 抑制作用随药物浓度的升高而增强,呈浓度依赖性(P<0.05)。当浓度升至200 μg/ml时,泮托拉唑对K562/A02细胞内p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、P-gp、MRP1基因抑制作用最为明显,与对照组相比,各基因mRNA水平的表达分别下降了(71.37±2.06)%,(62.29±4.17)%,(48.56±3.95)%,(52.05±4.26)%,(83.21±2.78)%,与对照组相比,差异具有统计学意义(t=5.902, P<0.05;t=4.736, P<0.05;t=3.992, P<0.05;t=5.323, P<0.05;t=5.679, P<0.05)。

图 2 RT-PCR检测p-PI3K(A)、p-Akt(B)、p-mTOR(C)、P-gp(D)、MRP1(E)基因的表达水平 M: marker; 1:阴性对照组; 2:50 μg/ml泮托拉唑; 3: 100 μg/ml泮托拉唑; 4:200 μg/ml泮托拉唑
2.4 泮托拉唑对K562/A02细胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、P-gp、MRP1蛋白表达的影响

与对照组相比,50 μg/ml泮托拉唑预处理24 h可显著抑制K562/A02细胞内的p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、P-gp、MRP1蛋白水平的表达(P<0.05), 抑制作用随药物浓度的升高而增强,呈浓度依赖性(P<0.05)。当浓度升至200 μg/ml时,泮托拉唑对K562/A02细胞内p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、P-gp、MRP1基因抑制作用最为明显,与对照组相比,各基因蛋白水平的表达分别下降了(50.93 ±4.09)%,(45.64±4.75)%,(42.77±3.33)%, (39.29±2.34)%, (69.87±3.51)%,与对照组相比,差异具有统计学意义(t=4.772, P<0.05;t=5.762, P<0.05;t=3.829, P<0.05;t=5.646, P<0.05;t=4.922, P<0.05)。

3 讨论

化疗耐药是导致化疗失败及白血病复发的一个重要原因,如何逆转化疗耐药性成为目前研究的热点。经典的多药耐药机制与多药耐药相关蛋白1(MDR1)基因及其产物P-糖蛋白(P-gp)有关[4, 5]。肿瘤细胞膜P-gp过度表达,通过其药物外排作用将药物泵出细胞外,胞内药物浓度下降,导致多药耐药。MRP1也与化疗多药耐药机制相关[6]。MRP是一类跨膜转运蛋白,在正常组织中低表达,在肿瘤组织中高表达。MRP作为药物排出泵,通过引起细胞内化疗药物浓度降低,进而导致肿瘤细胞对多种化疗药物产生耐药。研究发现,MRP蛋白在血液肿瘤中高表达,与血液肿瘤的多药耐药机制相关,同时与肿瘤恶化、化疗预后及患者整体生存率相关。

图 3 Western Blot检测p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、P-gp、MRP1蛋白的表达水平 1:阴性对照组; 2:50 μg/ml泮托拉唑; 3: 100 μg/ml泮托拉唑; 4:200 μg/ml泮托拉唑

PI3K/Akt/mTOR信号通路是细胞生存重要通路之一,近来研究发现[7]PI3K/Akt/mTOR信号通路与药物耐药性密切相关。研究表明[8],PI3K/Akt/mTOR信号通路在血液肿瘤中过度活化。Wang等[9]研究发现,在白血病耐药株K562/ADM细胞中,通过激活PI3K/Akt信号通路,诱导P-gp和MRP1表达上调,导致白血病K562/ADM细胞对化疗药物的多药耐药。Zhang等研究发现[10],在慢性粒细胞性白血病中PI3K/Akt信号通路过度激活,P-gp蛋白表达上调,通过降低PI3K/Akt信号通路可逆转肿瘤的多药耐药。

缺氧和酸化是肿瘤细胞微环境最主要的特征。研究发现质子泵抑制剂在酸性环境中被激活,且能逆转多种肿瘤的多药耐药。本实验中,我们将泮托拉唑预处理K562/A02细胞,观察诱导凋亡作用。结果发现泮托拉唑能诱导K562/A02细胞凋亡,此作用呈浓度依赖性。我们进一步探讨了可能的相关机制。与对照组相比,50 μg/ml泮托拉唑预处理24 h可显著抑制K562/A02细胞内的p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、P-gp、MRP1基因mRNA和蛋白表达(P<0.05), 抑制作用随药物浓度的升高而增强,呈浓度依赖性(P<0.05)。当浓度升至200 μg/ml时,泮托拉唑对K562/A02细胞内p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、P-gp、MRP1基因mRNA和蛋白表达抑制作用最为明显,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。

综上所述,泮托拉唑可通过抑制胞内PI3K/Akt/mTOR信号通路,进而抑制P-gp和MRP1蛋白表达,以增强肿瘤细胞的化疗敏感性,逆转其对化疗药物的MDR。泮托拉唑有望成为一种新型肿瘤化疗佐剂,但目前研究尚处于细胞水平,后续动物实验仍有待进一步开展。

参考文献
[1] Li C, Guan X, Xue H, et al. Reversal of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance is induced by saikosaponin D in breast cancer MCF-7/adriamycin cells[J]. Pathol Res Pract, 2017, 213(7): 848-853. DOI: 10.1016/j.prp.2017.01.022.
[2] Liu T, Li Z, Zhang Q, et al. Targeting ABCB1 (MDR1) in multi-drug resistant osteosarcoma cells using the CRISPR-Cas9 system to reverse drug resistance[J]. Oncotarget, 2016, 7(50): 83502-83513.
[3] Karaca RO, Kalkisim S, Altinbas A, et al. Effects of genetic polymorphisms of cytochrome P450 enzymes and MDR1 transporter on pantoprazole metabolism and helicobacter pylori eradication[J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2017, 120(2): 199-206. DOI: 10.1111/bcpt.2017.120.issue-2.
[4] Yuan ZT, Shi XJ, Yuan YX, et al. Bufalin reverses ABCB1-mediated drug resistance in colorectal cancer[J]. Oncotarget, 2017, 8(29): 48012-48026.
[5] Yan YY, Wang F, Zhao XQ, et al. Degradation of P-glycoprotein by pristimerin contributes to overcoming ABCB1-mediated chemotherapeutic drug resistance in vitro[J]. Oncol Rep, 2017, 37(1): 31-40. DOI: 10.3892/or.2016.5230.
[6] Wu J, Wang D. CLIC1 induces drug resistance in human choriocarcinoma through positive regulation of MRP1[J]. Oncol Res, 2017, 25(6): 863-871. DOI: 10.3727/096504016X14772315906527.
[7] Wang L, Wang C, Jia Y, et al. Resveratrol increases anti-proliferative activity of bestatin through downregulating P-glycoprotein expression via inhibiting PI3K/Akt/mTOR pathway in K562/ADR cells[J]. J Cell Biochem, 2016, 117(5): 1233-1239. DOI: 10.1002/jcb.v117.5.
[8] Chen JR, Jia XH, Wang H, et al. With no interaction, knockdown of Apollon and MDR1 reverse the multidrug resistance of human chronic myelogenous leukemia K562/ADM cells[J]. Oncol Rep, 2017, 37(5): 2735-2742. DOI: 10.3892/or.2017.5535.
[9] Wang H, Jia XH, Chen JR, et al. Osthole shows the potential to overcome 16-glycoproteinmediated multidrug resistance in human myelogenous leukemia K562/ADM cells by inhibiting the PI3K/Akt signaling pathway[J]. Oncol Rep, 2016, 35(6): 3659-3668. DOI: 10.3892/or.2016.4730.
[10] Zhang X, Dong W, Zhou H, et al. α-2, 8-sialyltransferase is involved in the development of multidrug resistance via PI3K/Akt pathway in human chronic myeloid leukemia[J]. IUBMB Life, 2015, 67(2): 77-87. DOI: 10.1002/iub.1351.